如何為您的實(shí)驗選擇最佳濾光片

　　濾光片可以成就，也能夠破壞熒光顯微鏡實(shí)驗。它們是每個(gè)熒光顯微鏡設置的關(guān)鍵組成部分，甚至有可能在最新 LED 顯微鏡照明提供的高速、高對比度成像方面取得突破。但是，最佳濾光片的選擇和配置可能困難重重。在本白皮書(shū)中，我們將引導您找到問(wèn)題的答案，幫助您為所需應用選擇出最適合的濾光片。

　　您將了解：

　　如何為您的實(shí)驗選擇最合適的濾光片 ?

　　哪些 Pinkel 和 Sedat 配置可實(shí)現高速成像 ?

　　使用 LED 照明時(shí)有關(guān)濾光片的五個(gè)重要提示

　　在設計熒光顯微鏡實(shí)驗時(shí)，為了獲取高質(zhì)量數據，科學(xué)家通常需要同時(shí)考慮光源、濾光片和熒光團的選擇。我們的許多技術(shù)資源都集中在不同光源的特性與優(yōu)勢上，而本白皮書(shū)也將提供有關(guān)“為寬場(chǎng)熒光顯微鏡(widefield fluorescence microscopy)選擇光學(xué)濾光片”的指導。

　　了解濾光片

　　一個(gè)標準的熒光顯微鏡裝置通常包括三個(gè)裝在熒光激發(fā)塊(filter cube)中的組件——激發(fā)濾光片(excitation filter)、二色鏡( dichroic mirror / beam splitter，也稱(chēng)為二向色濾光片)和發(fā)射光濾光片(emission filter)，如下圖 1 所示：

　　激發(fā)濾光片——選擇來(lái)自光源的光的波長(cháng)以匹配熒光團的吸收光譜。

　　二色鏡——選擇并傳輸樣本發(fā)出的熒光，并透射樣品發(fā)出的較長(cháng)波長(cháng)。

　　發(fā)射光濾光片—— 僅選擇與熒光團發(fā)射曲線(xiàn)相對應的波長(cháng)，同時(shí)通過(guò)阻擋自發(fā)熒光、來(lái)自房間的雜散光或反射的 LED 光來(lái)增加對比度。

　　用于 GFP 成像的濾光片和光源。使用 CoolLED pE-100(藍色圖)的 470 nm LED 對 GFP 進(jìn)行單波長(cháng)成像，沿其激發(fā)光譜(淺綠色)激發(fā) GFP。激發(fā)光路穿過(guò)激發(fā)濾光片(紫色)，低于 495 nm 的波長(cháng)被分色鏡(紅色)反射到樣品上。該能量被吸收并以熒光的形式釋放，形成 GFP 發(fā)射光譜(深綠色)，二色鏡(紅色)將 495 nm 以上的光透射到檢測器。背景噪聲被發(fā)射光路中的發(fā)射光濾光片(黃色)進(jìn)一步去除。

　　實(shí)驗室有數以千計的濾光片和二色鏡可供選擇，而這種選擇取決于單個(gè)熒光團和光源。濾光片的適用性主要取決于它阻擋或透射的波長(cháng)，圖 2 就是例子之一。它顯示了 GFP 的光譜圖，由 470 nm 的 LED 和優(yōu)化的單波段濾光片組激發(fā)。

　　首先，我們可以看到 藍色的LED 光譜與淺綠色 GFP 的吸收光譜重疊，因此光源與熒光團兼容。紅色的二色鏡反射波長(cháng)小于 495 nm 的光，并將激發(fā)光路導向樣品。在發(fā)射光路中，它會(huì )將 495 nm 以上的波長(cháng)傳輸到檢測器。這對于 GFP 而言是理想的，因為峰值吸收和發(fā)射之間發(fā)生了分裂，即 GFP 的相關(guān)激發(fā)波長(cháng)被反射到樣品上，且相關(guān)的發(fā)射波長(cháng)到達了檢測器。

　　紫色的激發(fā)光濾光片是專(zhuān)門(mén)用于傳輸 GFP 吸收光譜所需的 LED 的相關(guān)波長(cháng)。請注意伸至 525 nm 的 LED“尾巴”：由于二色鏡無(wú)法提供完美的分光，超過(guò) 495 nm 的某些波長(cháng)會(huì )被反射到樣品上，或反射到發(fā)射路徑中并形成背景。但是，它會(huì )首先被激發(fā)濾光片阻擋，隨后再被 GFP 吸收的能量以深綠色熒光發(fā)射的形式釋放。在這種情況下，黃色的發(fā)射光濾光片會(huì )進(jìn)一步阻擋來(lái)自 GFP 發(fā)射峰值范圍之外的所有光。

　　多重熒光：如何通過(guò)濾光片來(lái)進(jìn)行有效配置?

　　對單個(gè)熒光團進(jìn)行成像相對簡(jiǎn)單，只需要在顯微鏡中安裝一個(gè)熒光激發(fā)塊。然而，在單個(gè)實(shí)驗中捕獲多個(gè)熒光團則需要額外考慮平衡速度、對比度和預算。

　　單波段濾光片——多個(gè)單波段熒光激發(fā)塊(如圖 1 所示)可被安裝于電動(dòng)顯微鏡濾光片轉輪(motorised microscope filter cube turret)中，以實(shí)現高對比度成像，因為每個(gè)激發(fā)塊都包含特定于各個(gè)熒光團的濾光片組。然而，激發(fā)塊之間的切換速度很慢，將多標記樣本的動(dòng)態(tài)觀(guān)察速度限制在秒級。

　　多波段濾光片——為了實(shí)現多個(gè)熒光團的同時(shí)成像，多波段濾光片選擇性地傳輸/阻擋多個(gè)波長(cháng)。然而，完整的多波段集可能會(huì )導致交叉干擾(cross talk / bleed through，即其中一個(gè)通道的發(fā)射通過(guò)另一個(gè)通道的二色鏡和發(fā)射光濾光片傳輸)的對比度降低。通過(guò)在被稱(chēng)為 Pinkel 和 Sedat 的配置中組合單波段和多波段濾光片，研究人員能夠有效減少滲透。

　　Pinkel 濾光片——這種配置使用帶有多波段二色鏡和多波段發(fā)射光濾光片的單波段激發(fā)光濾光片。通過(guò)利用 LED 照明系統的獨立通道切換(如 CoolLED pE-800 系列)，其中單波段濾光片被安裝于照明系統中(每個(gè) LED 的前面)，可以在 <7 μs 的速度下進(jìn)行順序成像。然而，由于熒光團發(fā)射的廣譜特性，在某些實(shí)驗中，多波段發(fā)射光濾光片仍可能存在一些交叉干擾和對比度降低的風(fēng)險 熒光團發(fā)射的性質(zhì)

　　Sedat 濾光片——為避免交叉干擾，Sedat 濾光片配置使用與 Pinkel 類(lèi)似的設置，但也使用單波段發(fā)射光濾光片。為了避免使用發(fā)射光濾光輪(emission filter wheels)(因為移動(dòng)會(huì )引入延遲并限制成像速度)，一個(gè)聰明的技巧是：將圖像分離器合并到發(fā)射光路中。它們將發(fā)射光路分成最多四個(gè)圖像，并顯示在相機芯片的不同區域(或不同的相機)，并容納位于光路中的單波段發(fā)射光濾光片。這種設置結合了 Sedat 濾光片組的高對比度和 <7 μs LED 開(kāi)關(guān)速度。

　　有關(guān)濾光片的重要提示

　　升級照明系統時(shí)，請檢查您的濾光片：此前，濾光片是圍繞汞和金屬鹵化物燈的輻照度峰值設計的。當與 LED 照明系統一起使用時(shí)，激發(fā)光濾光片的不良匹配會(huì )降低激發(fā)光輻照度，從而降低信號——這可能會(huì )影響圖像質(zhì)量并進(jìn)一步影響數據的解釋。若實(shí)驗室升級光源，您需要重新考慮您的濾光片。實(shí)驗室現在可以使用與 LED 兼容的濾光片，來(lái)匹配 LED 和流行熒光團的光譜。

　　LED 與激光(laser)不同：與激光相比，每個(gè) LED 都具有更廣的光譜，且可以使用濾光片定制以激發(fā)更廣泛的熒光團。例如，若與適當的激發(fā)光濾光片一起使用，CoolLED pE-300 系列的藍色 LED 可以激發(fā) CFP、GFP 或 Ch2。

　　利用單個(gè) LED 增強對比度：沒(méi)有濾光片可以完全阻擋不需要的光。因此，與使用具有單獨通道控制的 LED 照明技術(shù)相比，白光照明將導致更高的背景(因此對比度也更低)。

　　LED 需要激發(fā)光濾光片：即使僅使用相應的 LED 來(lái)激發(fā)熒光團， 每個(gè) LED 光譜也都會(huì )有一個(gè)“尾巴”，如果不使用激發(fā)光濾光片來(lái)阻擋，它會(huì )導致背景噪聲(如圖 2所示)。

　　若您有特定的濾光片要求：濾光片制造商不會(huì )在其網(wǎng)站上列出所有濾光片，若您聯(lián)系他們詢(xún)問(wèn)，他們很可能會(huì )為您提供適合您定制需求的濾光片。